Trang chủ   Tin tức   Cơ sở dữ liệu    Đăng ký   Giới thiệu   Tìm kiếm: 
Infinite Menus, Copyright 2006, OpenCube Inc. All Rights Reserved.

Tương thích với

TIN TỨC > PHÂN LOẠI THỰC VẬT

Nhân gen mã hoá rarn 5,8s ở loài Trà hoa vàng Camellia petelotii Vườn Quốc gia tam Đảo

Cập nhật ngày 4/12/2008 lúc 4:47:00 PM. Số lượt đọc: 1415.

Theo những thống kê chưa đầy đủ thì số lượng loài trong chi Camellia khá lớn (khoảng 300 loài), trong đó nhiều loài có dạng đồng hình. [1] Chính vì vậy việc phân loại chi Camellia dựa trên các phương pháp phân loại cổ điển như: phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so sánh,.. đôi khi gặp phải những khó khăn nhất định, cần phải có sự hỗ trợ của các phương pháp phân loại hiện đại.

Mở đầu

Chi Trà - Camellia thuộc họ Chè - Theaceae là một thực vật quý của Việt Nam. Các loài Camellia không những có vai trò quan trọng tham gia vào cấu trúc hệ thực vật nhiệt đới vùng núi mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế. Nhiều loài Trà được dùng làm đồ uống, dầu ăn, làm thuốc... và đặc biệt phải kể đến đó là giá trị về mặt cây cảnh. Các loài trong chi Camellia đều có hoa to và đẹp, nhiều màu sắc khác nhau, mùa nở hoa của chúng lại đúng vào dịp Tết (từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau). Chính vì vậy tiềm năng kinh tế về mặt làm cây cảnh của các loài trong chi Camellia là rất lớn, trong số đó các loài Trà hoa vàng hiện nay đang được đặc biệt quan tâm.

Theo những thống kê chưa đầy đủ thì số lượng loài trong chi Camellia khá lớn (khoảng 300 loài), trong đó nhiều loài có dạng đồng hình. [1] Chính vì vậy việc phân loại chi Camellia dựa trên các phương pháp phân loại cổ điển như: phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so sánh,.. đôi khi gặp phải những khó khăn nhất định, cần phải có sự hỗ trợ của các phương pháp phân loại hiện đại.

Thực tế hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử, phương pháp phân loại phân tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong phân loại học nói chung và phân loại thực vật nói riêng. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng đối với đối tượng thực vật việc giải trình tự gen mã hoá rARN 5,8S cũng như một số vùng gen khác như ITS1, ITS2, microsatellite... là một trong những công cụ hữu hiệu của phân loại phân tử.[3]

Việc phân loại loài Trà hoa vàng Camellia petelotii ở Vườn Quốc gia Tam Đảo cho đến này vẫn tồn tại hai ý kiến trái ngược nhau: 1 ý kiến cho rằng loài Trà này và loài Trà Camellia chrysantha ở Trung Quốc chỉ là một, ý kiến khác lại cho rằng 2 loài này là khác nhau và loài Trà Camellia petelotii là loài đặc hữu của Việt Nam, chỉ có ở Vườn Quốc gia Tam Đảo. Đến nay 2 ý kiến này vẫn chưa đi đến thống nhất, vì vậy việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử đối với trường hợp này là cần thiết và sẽ góp phần đưa đến thống nhất việc phân loại loài Trà Camellia petelotii.

Trong bài này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu về nhân gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu phân loại phân tử tiếp theo.

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

Mẫu lá của loài Camellia petelotii ở Vườn Quốc gia Tam Đảo do TS. Trần Ninh, bộ môn Thực vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp.

Các hoá chất và dụng cụ thí nghiệm do các hãng Sigma, Bio - Rad,... cung cấp đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật của Samuel S. M. Sun và cộng sự (1994) [6] có 1 vài thay đổi cho phù hợp với đối tượng.

- Phương pháp phát hiện và kiểm tra độ sạch của ADN bằng điện di trên gel agarose. [5]

- Phương pháp nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR. [5]

Kết quả và thảo luận

Tách chiết ADN tổng số từ lá Camellia petelotii

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN theo qui trình sau:

Nghiền 0,75g lá trong Nitơ lỏng, bổ sung 5ml đệm chiết ở 600C (CTAB 2%, NaCl 1,4M, b - mercaptoetanol 0,2%, EDTA 20mM, Tris - HCl 100mM).

Ủ mẫu ở 600C trong 30 phút, bổ sung hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24: 1), trộn đều.

Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Thu pha trên, tủa trong cồn tuyệt đối, rửa tủa bằng cồn 800.

Hoà tan tủa bằng đệm TE.

Kết quả kiểm tra sự có mặt của AND tổng số được thẻ hiẹn trên hình 1.


Hình 1: ADN tổng số chưa loại ARN của loài Camellia petelotii

Qua hình 1 ta thấy xuất hiện 1 băng ADN đậm có kích thước khoảng 23.1 kb. Kích thước này phù hợp với kích thước ADN tổng số ở thực vật chứng tỏ trong dịch chiết có chứa ADN tổng số. Tuy nhiên băng ADN còn chưa gọn và phía dưới còn có vệt sáng ARN, vì vậy chúng tôi đã tiến hành loại ARN bằng RNase. Kết quả thể hiện trên hình 2.


Hình 2: ADN tổng số đã loại ARN của loài Camellia petelotii

 

M: Marker - ADN ở cắt bằng Hind III
Giếng 1, 2: ADN tổng số đã loại ARN

Qua hình 2 ta thấy băng ADN tổng số sau khi loại ARN đậm và gọn hơn, đồng thời vệt sáng ARN phía dưới đã hoàn toàn biến mất. Điều đó chứng tỏ ARN trong dịch chiết đã được loại bỏ hoàn toàn.

Nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR

Để nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S của loài Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá rARN 5,8S của chi Camellia. Cặp mồi này được thiết kế dựa trên việc so sánh trình tự gen ADNr 5,8S cuả 2 loài trong chi Camellia đã được công bố trên mạng Internet: Camellia fascicularisCamellia nitidissima.
Cf: Camellia fascicularis
Cn: Camellia nitidissima

Hình 3: So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở 2 loài Trà Camellia fascicularisCamellia nitidissima

Các trình tự này được xử lý nhờ phần mềm PC - GEN và qua đó có được cặp mồi có kí hiệu và trình tự như sau:

HP1 (mồi xuôi)     : 5' GCC CGC CGG GAG CGC GCC CG 3'
HP2 (mồi ngược)  : 5' GGC CTC CCG AGA CGG CGC GG 3'

Sử dụng cặp mồi này chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các thành phần và chu trình nhiệt như sau:


* Thành phần của phản ứng PCR:


* Chu trình nhiệt:





Hình 4: Phổ điện di sản phẩm PCR
L: Ladder - Thang ADN chuẩn 100 bp


Giếng 1: Sản phẩm PCR

Kết quả của phản ứng PCR được thể hiện trên hình 4.

Qua hình 4 ta thấy chỉ xuất hiện 1 băng ADN duy nhất, đậm, gọn có kích thước gần 500bp, phù hợp với kích thước mà chúng tôi dự kiến trong quá trình thiết kế mồi. Như vậy có thể nói với cặp mồi này chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii.

Kết luận

1. Đã tách chiết được ADN tổng số của loài Trà Camellia petelotii. Sản phẩm ADN thu được đủ hàm lượng và độ sạch cho các nghiên cứu tiếp theo.

2. Đã nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chi Camellia.

Tài liệu tham khảo

1. Trần Ninh (2001), Kết quả nghiên cứu phân loại các loài Trà hoa vàng của Việt Nam, Báo cáo tại Hội thảo các loài Trà hoa vàng ở Việt Nam.
2. Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. Cox (1993), Principles of biochemistry, Worth publishers.
3. David V. Jobes, Lconard B. Thien (1997), "A Conserved Motif in the 5,8S ribosomal RNA gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences", Plant moleculer biology reporter, (15), pp. 326 - 331.
4. Pauline Nicholson (1997), "extraction of DNA from plant system", Life science news, (23), pp 12 - 14.
5. Sambrook J. , Fritsch E. F., Maniatis T. (1989), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
6. Samuel S. M. Sun (1994), Methods in plant moleculer biology and agricultural biotechnology, Asian Vegetable Research and Developement Center, Taiwan.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. Trịnh Đình Đạt.

Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc Phong
Khoa Sinh học, ĐHKHTN Hà Nội

(Theo Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, số 3 năm 2003)

Đánh giá:      Google Bookmarks Facebook Twitter   Gửi email     Bản để in     Phản hồi

SÁCH THAM KHẢO

CÁC BÀI MỚI HƠN:
CÁC BÀI ĐĂNG TRƯỚC:
TIN BÀI MỚI NHẤT


ĐƯỢC XEM NHIỀU NHẤT

SÁCH THAM KHẢO

LIÊN KẾT WEBSITE

 
 
 
 
 
 
 

TỪ KHÓA

BVN - BotanyVN - Botany Research and Development Group of Vietnam
(©) Copyright 2007-2021